Mikrobiom-Sequenzen clustern: 90 % Cluster-Homogenität

Veränderungen der Darm-Mikrobiota geben Aufschluss über das Zusammenspiel von Wirt und Mikrobiom und können neue Optionen für therapeutische Interventionen aufzeigen. Der Weg dorthin führt über Sequenzdaten – und die sind in Rohform kaum interpretierbar: sehr viele Sequenzen, hohe Ähnlichkeit untereinander, keine unmittelbar erkennbare Ordnung.

Dazu kommen zwei Störgrößen, die vor der biologischen Auswertung liegen. Erstens vermischen Proben aus dem menschlichen Körper zwangsläufig Wirts- und Bakteriensequenzen. Zweitens erzeugen technische Effekte aus der Probenverarbeitung Muster, die man leicht für biologische Signale hält. Wer beides nicht behandelt, interpretiert Artefakte.

Die Proben wurden aus dem Dickdarm entnommen und bestanden aus Stuhl und Blut. Die Rohdaten der Sequenzierung lagen als FASTQ-Dateien vor und wurden vom Auftraggeber bereitgestellt.

Unüberwachtes Clustering mit Self-Organizing Maps. SOM sind ein neuronales, unüberwachtes Clustering-Verfahren: Sie ordnen Sequenzen anhand ihrer Nukleotidfolge so an, dass ähnliche Sequenzen benachbart liegen, gemessen über euklidische Distanz. Zwei Eigenschaften waren für dieses Projekt entscheidend – SOM können Batch-Effekte ausgleichen und die durch technische Fehler verursachte Falsch-Positiv-Rate kontrollieren. Der Vorteil gegenüber vorgegebenen Kategorien: Die Struktur ergibt sich aus den Daten, auch dort, wo keine Referenz existiert.

Trennung von Wirts- und Bakteriengenom über BLAST. BLAST findet Ähnlichkeiten zwischen biologischen Sequenzen. Wir haben es eingesetzt, um menschliches Genom und Bakteriengenom voneinander zu trennen – der Schritt, ohne den jede nachfolgende Auswertung der mikrobiellen Zusammensetzung verzerrt bleibt – und anschließend, um die enthaltenen Mikroorganismen zu identifizieren.

Muster sichtbar machen. Heatmaps zeigen, welches Muster innerhalb eines Clusters dominiert. Damit ist das Ergebnis nicht nur eine Gruppierung, sondern eine interpretierbare Aussage über den Inhalt jeder Gruppe.

Die SOM lieferten Cluster mit hoher Homogenität: im Durchschnitt 90 % innerhalb der Cluster. Über die neuronale Repräsentation ließen sich Ähnlichkeiten in einer großen Zahl von DNA-Sequenzen auf Basis euklidischer Distanz identifizieren, und die Heatmaps machten für jedes Cluster das dominierende Muster erkennbar.

Aus den BLAST-Ergebnissen ergab sich ein detailliertes Bild der Mikroorganismen-Zusammensetzung bei den untersuchten Patienten. Diese Ergebnisse sind Grundlage für weitergehende Fragestellungen: die Interaktion zwischen Wirt und Mikrobiota, die Wirkung von Medikamenten und der Einfluss von Umweltfaktoren.

Das Muster – unüberwacht strukturieren, Störquellen vor der biologischen Auswertung entfernen, Ergebnisse interpretierbar darstellen – trägt über die Mikrobiomanalyse hinaus. Es greift überall, wo große Mengen ähnlicher biologischer Sequenzen oder Profile geordnet werden müssen, bevor eine Fragestellung überhaupt beantwortbar ist.

In der Mikrobiomanalytik haben sich seit diesem Projekt verlässliche Standards etabliert. Wir arbeiten heute mit nf-core/ampliseq in Nextflow: Denoising zu exakten Sequenzvarianten mit DADA2, Taxonomie über QIIME2 gegen SILVA oder GTDB, containerisiert und versionsfixiert, damit eine Auswertung Jahre später reproduzierbar bleibt.

Die Trennung der Wirtssequenzen läuft nicht mehr über BLAST, sondern über gezieltes Alignment gegen eine menschliche Referenz mit minimap2 oder Bowtie2 – schneller und vollständiger.

Batch-Effekte behandeln wir heute mit dafür entwickelten Verfahren statt als Nebeneffekt des Clusterings.

Und wo unüberwachte Struktur gesucht wird, treten Embeddings genomischer Foundation Models wie Evo 2 an die Stelle handgebauter Merkmale, gefolgt von dichtebasiertem Clustering, das auch Gruppen unterschiedlicher Größe und Dichte erkennt.